Problème : la synthèse peptidique de Merrifield, et ce que coûte chaque étape

La stratégie. La synthèse en phase solide est une protection de plus — la résine protège l'extrémité carboxyle — et une machine à répéter le même couplage. Chaque opération a un rendement $r$ légèrement inférieur à 1 ; les rendements se multiplient, et l'on établit le prix exponentiel de la longueur.

1) Protéger l'entrant, accrocher par le carboxyle. L'acide α-aminé entrant est activé sur son carboxyle par le DCC. Si son azote était libre, il attaquerait le carboxyle activé d'une autre molécule entrante : les entrants se condenseraient entre eux en solution, au lieu de s'ajouter un par un à la chaîne. Le Fmoc ne laisse qu'un nucléophile dans le milieu : l'azote libéré au bout de la chaîne fixée. La chaîne est accrochée par son extrémité carboxyle (premier résidu fixé en ester sur la résine) : ce carboxyle est ainsi protégé, et l'autre extrémité, l'azote, est celle que l'on déprotège à chaque cycle. La chaîne croît donc de l'extrémité carboxyle vers l'extrémité amino, une unité par cycle, dans l'ordre inverse de celui où l'on lit la séquence.

2) La phase solide. Le peptide en croissance est fixé sur un solide insoluble : après chaque opération, on filtre et on lave, ce qui élimine les réactifs en excès, la DCU, la pipéridine et les sous-produits du Fmoc, sans aucune purification intermédiaire de l'intermédiaire peptidique. Comme l'excès de réactif s'élimine si facilement, on peut l'employer en large excès, ce qui pousse chaque couplage aussi près que possible de la conversion totale ($r\to 1$) : c'est précisément ce que la question 3 montre être indispensable. La méthode s'automatise.

3) Le rendement global. Une chaîne n'atteint la bonne séquence complète que si toutes les opérations ont réussi sur elle. Si chacune réussit avec la probabilité $r$, indépendamment des autres, la fraction des chaînes complètes après $N$ couplages et $N$ déprotections est

$$\rho =r^{2N}.$$

La décroissance est exponentielle en $N$ : $\rho ={\mathrm{e}}^{2N\ln r}\approx {\mathrm{e}}^{-2N(1-r)}$ quand $r$ est voisin de 1. Le rendement global reste au-dessus de $0,5$ tant que $r^{2N}⩾0,5$, soit $N⩽\frac{\ln 0,5}{2\ln r}$ : $N⩽34$ pour $r=0,99$ ; $N⩽69$ pour $r=0,995$ ; $N⩽346$ pour $r=0,999$. La courbe ci-dessous montre $\rho (N)$ pour les trois valeurs de $r$.

Un rendement de 99 % par étape, excellent en synthèse classique, ne laisse qu'un peptide de cinquante résidus sur trois correct.

4) Les chaînes de délétion. Une chaîne manque exactement une des $2N=100$ opérations avec la probabilité $2N(1-r)r^{2N-1}$ (une opération manquée parmi cent, les quatre-vingt-dix-neuf autres réussies) :

$$100\times 0,01\times 0,99^{99}=0,370.$$

Plus d'un tiers des chaînes sont des peptides « à une unité près » : il leur manque un résidu quelque part dans la séquence (on dit des peptides de délétion). Ce sont les impuretés les plus gênantes : même extrémités, mêmes groupes, masse et polarité très voisines de celles du produit voulu (49 résidus sur 50 identiques) : leur séparation est très difficile. C'est la pureté qui devient inaccessible.

5) La coupure finale par le TFA. Le TFA concentré retire en une seule opération : le lien résine–peptide (ester d'alcool benzylique de la résine, libéré en acide carboxylique), et toutes les protections tert-butyliques des chaînes latérales (esters et éthers). Le Fmoc du dernier résidu a déjà été retiré par la pipéridine, lors d'une dernière déprotection : c'est l'orthogonalité Fmoc / tert-butyle (base contre acide) qui permet, à chaque cycle, de retirer le Fmoc sans toucher aux chaînes latérales, puis, à la fin, de tout libérer d'un coup. Une chaîne latérale protégée en ester benzylique ne serait pas libérée par le TFA : dans cette banque, elle exige une hydrogénolyse. On choisit donc des protections de chaînes latérales qui partent avec le lien résine, dans la même opération finale.

6) Conclusion. Pour quelques dizaines de résidus, la synthèse chimique est excellente : l'ocytocine (neuf résidus) s'obtient avec un rendement global supérieur à 90 % si $r=0,995$ ($0,995^{18}=0,914$), et l'on peut y introduire des unités que la nature n'emploie pas. Pour une protéine de plusieurs centaines de résidus, $\rho =r^{2N}$ s'effondre même avec $r=0,999$ ($N=300$ : $0,999^{600}=0,55$, et les délétions deviennent inséparables) : on fait alors produire la protéine par des cellules, dont la machinerie de traduction se trompe bien moins souvent qu'une fois par mille liaisons, et qui ne passent par aucune protection.

Le résultat établi est le rendement global d'une synthèse itérative : pour $2N$ opérations successives de rendement $r$, $\rho =r^{2N}\approx {\mathrm{e}}^{-2N(1-r)}$, décroissance exponentielle avec la longueur.

Ce que l'exercice installe. Une synthèse itérative cumule ses pertes multiplicativement : $\rho =r^{2N}$, exponentielle en $N$, d'où l'exigence de couplages quasi totaux (réactifs en excès, rendus possibles par la phase solide). La stratégie de protection repose sur l'orthogonalité Fmoc (base, à chaque cycle) / tert-butyle (acide, une fois à la fin), la résine jouant le rôle d'une protection du carboxyle. Les impuretés « à une unité près » limitent la longueur accessible plus encore que le rendement.